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实时荧光定量PCR仪操作流程
点击次数：254 更新时间：2025-02-11
实时荧光定量PCR仪的基本原理是利用DNA聚合酶在PCR过程中合成新DNA链的特性，结合一种荧光标记的探针或染料，通过实时监测荧光信号的增加来测量PCR反应的进行程度。在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程。随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。
由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值(即样品到达域值水平所经历的循环数)和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以可以作为定量的依据。域值应设定在使指数期的扩增效率为最大，这样可以获得最准确、可重复性的数据。如果同时扩增的还有标有相应浓度的标准品，线性回归分析将产生一条标准曲线，可以用来计算未知样品的浓度。
使用实时荧光定量PCR仪的一般操作流程包括：
设计引物和探针：根据实验目的，选择合适的基因序列，设计特异性引物和荧光探针。
准备样本：提取待检测的核酸样本，如DNA或RNA，并确保样本的质量和纯度。
准备反应体系：将所需的试剂和样本加入PCR反应管中，组成反应体系。包括引物、探针、酶、缓冲液、dNTPs和核酸模板等。
设置仪器参数：打开仪器，选择合适的PCR程序，并根据实验要求设置温度、时间、循环次数等参数。同时，设置荧光检测通道和参数。
放置样本：将准备好的PCR反应管放入仪器的样品槽中，确保放置正确且稳固。
启动程序：确认设置无误后，启动PCR程序。仪器将按照设定参数进行温度循环和荧光检测。
实时监测与分析：通过仪器显示屏实时监测荧光信号变化，观察扩增曲线形状和趋势。实验结束后，仪器自动生成结果，包括扩增曲线、Ct值等。使用软件对结果进行分析和处理。
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